Kali Serayu atau Sungai Serayu (dulu juga disebut Ci Sarayu) adalah salah satu sungai di Jawa Tengah, Indonesia, sekitar 300 km di tenggara ibukota Jakarta. Membentang dari timur laut ke barat daya sejauh 181 km, sungai ini melintasi lima kabupaten yakni Kabupaten Wonosobo, Kabupaten Banjarnegara, Kabupaten Purbalingga, Kabupaten Banyumas, hingga bermuara di Samudra Hindia di wilayah Kabupaten Cilacap. Hulu sungai ini berada di lereng Gunung Prahu di wilayah Dieng, Wonosobo. Mata airnya dikenal sebagai Tuk Bima Lukar (mata air Bima Lukar). Memiliki banyak anak sungai, total daerah aliran sungai Serayu mencapai luas 4.375 km². Mengalir kurang lebih ke arah barat-barat daya, di sisi selatan aliran ini dibatasi oleh deretan perbukitan yang dinamai Pegunungan Serayu Selatan.
Selain Kali Serayu yang berhulu di G. Prahu dan G. Sindoro, beberapa anak sungainya di antaranya Kali Begaluh dari lereng G. Sumbing; Kali Tulis dari G. Prahu; Kali Merawu dari G. Prahu; Kali Klawing yang anak-anak sungainya kebanyakan berhulu di G. Slamet, G. Walirang dan G. Jaran; Kali Pekacangan (anak Kali Klawing) dari G. Rogojembangan; Kali Sapi yang berhulu di Pegunungan Serayu Selatan; Kali Banjaran, Kali Logawa, Kali Tenggulun, Kali Kawung, serta Kali Tajum, yang semuanya berhulu di G. Slamet. Kali Serayu mempunyai debit air yang cukup besar. Di bagian hulu di wilayah Banjarnegara, sungai ini memiliki debit 656 m³/detik. Dengan bertambahnya air yang masuk dari anak-anak sungainya, di bagian hilir debit ini meningkat menjadi sebesar 2.866 m³/det dan 2.797 m³/det, berturut-turut di Banyumas dan Rawalo.
Bendungan Panglima Besar Sudirman dibangun di Kali Serayu ini lk. 10 km di barat kota Banjarnegara. Bendungan yang juga dikenal dengan sebutan Waduk Mrica atau Mrican ini memiliki luas genangan lk. 12 km², jika terisi penuh. Selain dimanfaatkan untuk pengairan dan wisata, Waduk Mrica terutama dibangun untuk memasok PLTA Mrica berkapasitas 184,5 MW. Wisata petualangan arung jeram telah dikembangkan di bagian hulu Kali Serayu. Wisatawan biasanya memulai kegiatan ini dari Desa Tunggara dan Desa Prigi di Banjarnegara. Kelestarian perairan Kali Serayu terutama terancam oleh sedimentasi, dan belakangan juga oleh polusi air. Sedimentasi atau pelumpuran di sungai ini diakibatkan oleh erosi tanah, terutama yang terjadi di wilayah dataran tinggi Dieng. Catatan tahun 2005 menyebutkan bahwa di sepanjang daerah aliran Serayu masih ada 187 industri yang belum memiliki instalasi pengolahan air limbah standar, termasuk 92 rumah sakit, 124 hotel, dan belasan usaha lain. Akan tetapi cukup banyak pula industri lokal dan perusahaan-perusahaan di Wonosobo, Banjarnegara, Purbalingga, Banyumas, dan Purwokerto yang telah sadar lingkungan dan mengikuti program kali bersih (Prokasih) untuk menyelamatkan Kali Serayu.